UXT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403823-ACT

L’UXT umano (ubiquitously expressed transcript) codifica una piccola proteina prevalentemente nucleare che funge da co-regolatore trascrizionale e da impalcatura (scaffold) per complessi multiproteici. UXT è stato implicato nel controllo dell’espressione genica dipendente da NF-κB e di altri programmi di segnalazione attraverso interazioni con fattori di trascrizione e con la macchina associata alla cromatina, collegandolo alla regolazione della progressione del ciclo cellulare, dell’apoptosi e delle risposte infiammatorie. Modellando l’output trascrizionale e la stabilità dei complessi proteici, UXT contribuisce all’omeostasi cellulare ed è stato associato in letteratura a stati di segnalazione alterati osservati nel cancro e in contesti di malattie immuno-correlate. Queste caratteristiche rendono UXT un nodo utile per studiare il cross-talk tra la regolazione trascrizionale e la segnalazione responsiva allo stress.

UXT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UXT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UXT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UXT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UXT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UXT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UXT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UXT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UXT nelle cellule tumorali con espressione di UXT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.