utrophin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400522-ACT

Das humane Gen **UTRN** kodiert **Utrophin**, ein mit Dystrophin verwandtes zytoskelettales Protein, das das Aktinnetzwerk mit dem Dystrophin–Glykoprotein-Komplex am Sarkolemm sowie an spezialisierten Membrandomänen wie der neuromuskulären Endplatte verbindet. Utrophin trägt zur Membranstabilität, zur Mechanotransduktion und zur Organisation adhäsionsassoziierter Signalgebung bei, indem es Interaktionen zwischen Komponenten der extrazellulären Matrix, transmembranen Rezeptoren und intrazellulären Gerüstproteinen koordiniert. Seine Expression ist entwicklungsabhängig reguliert und an synaptischen Regionen häufig angereichert, was Studien zur Architektur von Muskelfasern und zur Aufrechterhaltung von Synapsen unterstützt. Veränderungen in Menge oder Lokalisation von Utrophin werden häufig im Kontext der Biologie der Muskeldystrophie sowie kompensatorischer Signalwege untersucht, die die Muskelintegrität beeinflussen.

utrophin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UTRN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

utrophin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UTRN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UTRN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen utrophin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UTRN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von utrophin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des utrophin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UTRN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.