USP45 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-429548-ACT-2

Das Mausgen Usp45 kodiert USP45, eine ubiquitinspezifische Protease, die Ubiquitinmodifikationen von Zielproteinen entfernt, um deren Stabilität und Signalweitergabe zu regulieren. USP45 ist an der DNA-Schadensantwort beteiligt und unterstützt die Erhaltung des Genoms durch Deubiquitinierungsereignisse, die die Wahl des Reparaturwegs und die Toleranz gegenüber Replikationsstress beeinflussen, einschließlich der Koordination mit Netzwerken posttranslationaler Modifikationen wie der Ubiquitin- und SUMO-Signalgebung. Eine Störung der durch USP45 vermittelten Deubiquitinierung kann chromatinassoziierte Reparaturprozesse beeinträchtigen, die genomische Instabilität erhöhen und wurde mit für die Krebsbiologie und Entwicklungsdefekte relevanten Phänotypen in Verbindung gebracht. Auf Usp45 ausgerichtete Geneditierung sowie funktionelle Genomikstudien in Maus-Zellen ermöglichen die mechanistische Aufschlüsselung ubiquitinabhängiger DNA-Reparaturschaltkreise, die Identifizierung von USP45-Substraten und Interaktionspartnern sowie die Modellierung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in Signalwegen der Genomintegrität.

USP45 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Usp45-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

USP45 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Usp45-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Usp45-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen USP45-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Usp45-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von USP45-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des USP45-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Usp45-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.