Plasmide CRISPR d'Activation (h) UFD1: sc-403304-ACT

UFD1L code UFD1, un composant central du complexe UFD1–NPL4–VCP/p97, qui couple la reconnaissance de l’ubiquitine à l’extraction, dépendante de l’ATP, de protéines à partir des membranes et d’assemblages macromoléculaires en vue de leur dégradation par le protéasome. Cet axe soutient la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD), le contrôle qualité associé aux ribosomes et la résolution de complexes protéiques bloqués, contribuant ainsi au maintien de la protéostasie en situation de stress. Par ces processus, UFD1 influence la progression du cycle cellulaire, la stabilité du génome et les réponses au stress lié aux protéines mal repliées. Le dérèglement des voies de contrôle qualité liées à UFD1L a été associé à une tolérance au stress altérée et à des phénotypes observés dans des troubles impliquant un déséquilibre de la protéostasie et des anomalies chromosomiques, ce qui étaye son intérêt pour la modélisation mécanistique des maladies.

UFD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UFD1L sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UFD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UFD1L dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UFD1L, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UFD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UFD1L natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UFD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UFD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de UFD1L silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.