UBC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404360-ACT

Das humane UBE2A-Gen kodiert das E2-Ubiquitin-konjugierende Enzym UBC2, eine Kernkomponente des Ubiquitin-Proteasom-Systems, das aktiviertes Ubiquitin von E1-Enzymen auf E3-Ligasen überträgt und damit die Ubiquitinierung von Substraten unterstützt. Durch diese Aktivität trägt UBC2 zur Regulation der Proteinkontrolle, des Zellzyklus-Fortschritts und von DNA-Schadensantworten bei, indem es Ubiquitin-Signalwege und Proteostase-Netzwerke mitprägt. Die Funktion von UBE2A/UBC2 ist mit Signalwegen verknüpft, die den Abbau regulatorischer Proteine und die Anpassung an Stress steuern, und ist daher relevant für Studien zur neuronalen Entwicklung, Genomstabilität und zellulären Homöostase. Veränderte Ubiquitinierungsdynamiken unter Beteiligung von UBE2A wurden in krankheitsrelevanten Kontexten mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und einer dysregulierten Proteostase in Verbindung gebracht.

UBC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.