Tyrosinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400255-ACT

Das humane TYR-Gen kodiert die Tyrosinase, eine kupferabhängige Oxidase, die die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Melanogenese katalysiert, indem sie L‑Tyrosin in L‑DOPA und DOPAchinon umwandelt und damit letztlich die Synthese von Eumelanin und Phäomelanin in Melanosomen antreibt. Die TYR-Aktivität ist in Programme der Melanosomenbiogenese und des intrazellulären Transports eingebunden und mit transkriptionellen Netzwerken von Pigmentzellen koordiniert, wodurch sie das zelluläre Redoxgleichgewicht und UV-reaktive Stresssignalwege beeinflusst. Eine veränderte TYR-Funktion ist mit Pigmentierungsphänotypen und melaninassoziierten Erkrankungen verknüpft und wird häufig als molekularer Readout für die Differenzierung von Melanozyten und die Reifung von Melanosomen genutzt. Als auf eine Zelllinie beschränktes Enzym dient Tyrosinase zudem als nützliches Modell zur Untersuchung organell-spezifischer Enzymologie und regulierter Sekretion in Pigmentzellen.

Tyrosinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TYR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tyrosinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TYR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TYR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tyrosinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TYR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tyrosinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tyrosinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TYR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.