Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tyrosinase: sc-400255-ACT

Le gène humain **TYR** code la tyrosinase, une oxydase dépendante du cuivre qui catalyse les étapes limitantes de la mélanogenèse en convertissant la L-tyrosine en L-DOPA puis en DOPAquinone, entraînant in fine la synthèse de l’eumélanine et de la phéomélanine dans les mélanosomes. L’activité de TYR s’intègre aux programmes de biogenèse et de trafic des mélanosomes et se coordonne avec les réseaux transcriptionnels propres aux cellules pigmentaires, influençant l’équilibre rédox cellulaire et les voies de stress sensibles aux UV. Une altération de la fonction de TYR est associée à des phénotypes de pigmentation et à des troubles liés à la mélanine, et TYR est fréquemment utilisé comme marqueur moléculaire de la différenciation des mélanocytes et de la maturation des mélanosomes. En tant qu’enzyme restreinte à une lignée cellulaire, la tyrosinase constitue aussi un modèle utile pour étudier l’enzymologie spécifique d’organites et la sécrétion régulée dans les cellules pigmentaires.

Tyrosinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TYR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tyrosinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TYR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TYR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tyrosinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TYR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tyrosinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tyrosinase dans les cellules tumorales présentant une expression de TYR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.