TRPV4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401432-ACT

TRPV4 kodiert einen Ca2+-durchlässigen, mechanosensitiven TRP-Ionenkanal, der osmotische, thermische und mechanische Reize integriert, um die Membranerregbarkeit und die intrazelluläre Kalziumsignalübertragung zu regulieren. Die TRPV4-Aktivität ist an nachgeschaltete Signalwege gekoppelt, darunter calmodulinabhängige Signalgebung, MAPK-Kaskaden und zytoskelettales Remodeling, und beeinflusst Prozesse wie die Epithelbarrierefunktion, endotheliale Antworten auf Scherkräfte und die Mechanotransduktion in Chondrozyten. In humanen Geweben trägt TRPV4 in unterschiedlichen Zelltypen zur sensorischen Reiztransduktion und zur Volumenhomöostase bei. Eine veränderte TRPV4-Signalgebung wurde mit Pathophysiologien in Verbindung gebracht, die von Mechanismen neuropathischer Schmerzen über Skelettdysplasien bis hin zu pulmonalen und vaskulären Funktionsstörungen reichen, was TRPV4 zu einem nützlichen Ziel für die Untersuchung reizabhängiger Ca2+-Signalnetzwerke macht.

TRPV4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPV4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRPV4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPV4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPV4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRPV4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPV4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRPV4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRPV4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPV4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.