TRPM8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401744-ACT

TRPM8 (Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 8) ist ein kälte- und mentholempfindlicher, calciumpermeabler Ionenkanal, der die Membran-Erregbarkeit sowie die intrazelluläre Ca2+-Signalgebung reguliert. In menschlichen Zellen beeinflusst die TRPM8-Aktivität die sensorische Signaltransduktion, die osmotische und thermische Reaktionsfähigkeit sowie nachgeschaltete Signalwege, die mit Ca2+-abhängiger Transkriptions- und Kinase-Signalgebung gekoppelt sind. Eine veränderte TRPM8-Expression oder -Funktion wurde mit Änderungen der neuronalen Signalübertragung und des Verhaltens von Epithelzellen in Verbindung gebracht; zudem wird TRPM8 häufig im Kontext der Krebsbiologie, von Schmerz- und Sinnesstörungen sowie entzündungsassoziierten Prozessen untersucht. Als Plasmamembran-Kanal stellt TRPM8 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt dar, um die durch Ionenkanäle vermittelte Regulation von Zellzustand, Migration und reizinduzierter Signaldynamik zu untersuchen.

TRPM8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPM8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRPM8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPM8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPM8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRPM8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPM8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRPM8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRPM8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPM8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.