Plásmido CRISPR de Activación (h) Trp7: sc-408046-ACT

TRPM2 (también conocido como Trp7) codifica un canal catiónico no selectivo, permeable al Ca2+, de la familia TRP, que se activa por ADP-ribosa y se regula por el estrés oxidativo intracelular. El influjo de Ca2+ mediado por TRPM2 acopla las señales redox con procesos aguas abajo, entre ellos la función mitocondrial, la producción de citocinas y quimiocinas, las respuestas asociadas al inflamasoma y programas de muerte celular como la apoptosis y la necroptosis. El canal integra señales procedentes del metabolismo de NAD+ y de la señalización dependiente de PARP para modular la homeostasis del calcio y las respuestas transcripcionales adaptativas al estrés. La actividad desregulada de TRPM2 se ha implicado en mecanismos inflamatorios y neurodegenerativos, en la biología de la lesión por isquemia-reperfusión y en la señalización del microambiente asociada a tumores, lo que respalda su relevancia en modelos de disección de vías.

Trp7 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRPM2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Trp7 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRPM2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRPM2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Trp7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRPM2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Trp7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Trp7 en células tumorales con expresión de TRPM2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.