Troponin T-C CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400949-ACT

TNNT2 codiert das kardiale Troponin T, eine zentrale Komponente des Troponin-Komplexes, die regulatorische Untereinheiten am dünnen Filament verankert und Ca²⁺-Signale in koordinierte Aktin-Myosin-Interaktionen übersetzt. Durch die Modulation der Tropomyosin-Positionierung auf F-Aktin trägt TNNT2 dazu bei, Kinetik und Empfindlichkeit der Kontraktion und Relaxation des Sarkomers festzulegen, und integriert sich dabei in die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung sowie in Calcium-Regulationswege. Eine veränderte TNNT2-Expression oder -Funktion stört die myofibrilläre Organisation und die kontraktile Leistungsfähigkeit; TNNT2 wird zudem breit mit Phänotypen assoziiert, die mit erblichen und erworbenen Kardiomyopathien zusammenhängen. Als Marker der kardialen Zelllinie und funktioneller Knotenpunkt in der sarkomerischen Signalgebung wird TNNT2 häufig genutzt, um Myozytenreifung, Stressantworten und kontraktilitätsbezogene Transkriptionsprogramme zu untersuchen.

Troponin T-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNNT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Troponin T-C Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNNT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNNT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Troponin T-C-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNNT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Troponin T-C-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Troponin T-C-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNNT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.