Troponin T-C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400949-ACT

TNNT2 codifica la troponina T cardiaca, un componente fondamentale del complesso della troponina che ancora le subunità regolatorie al filamento sottile e traduce i segnali di Ca²⁺ in interazioni actina–miosina coordinate. Modulando il posizionamento della tropomiosina sull’F-actina, TNNT2 contribuisce a determinare la cinetica e la sensibilità della contrazione e del rilassamento del sarcomero, integrandosi con l’accoppiamento eccitazione–contrazione e con le vie di gestione del calcio. Alterazioni dell’espressione o della funzione di TNNT2 compromettono l’organizzazione miofibrillare e la performance contrattile, e TNNT2 è ampiamente implicato in fenotipi associati a cardiomiopatie ereditarie e acquisite. In quanto marcatore della linea cardiaca e nodo funzionale della segnalazione sarcomerica, TNNT2 è frequentemente utilizzato per studiare la maturazione dei miociti, le risposte allo stress e i programmi trascrizionali legati alla contrattilità.

Troponin T-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNNT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Troponin T-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNNT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNNT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Troponin T-C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNNT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Troponin T-C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Troponin T-C nelle cellule tumorali con espressione di TNNT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.