TRIM32 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402731-ACT

TRIM32 kodiert eine E3-Ubiquitin-Ligase der TRIM-Familie, die die Protein-Homöostase reguliert, indem sie die Ubiquitinierung von Substraten katalysiert und deren proteasomalen Abbau koordiniert. Über seine RING-, B-Box-, Coiled-Coil- und NHL-Repeat-Domänen beeinflusst TRIM32 die myogene Differenzierung, die Organisation des Zytoskeletts und stressresponsive Signalwege; beschrieben wurden dabei Zusammenhänge mit Signalachsen wie NF-κB sowie mit autophagiebezogener Qualitätskontrolle. In der Humanbiologie ist eine veränderte TRIM32-Funktion mit neuromuskulären Phänotypen wie der Gliedergürteldystrophie und kongenitalen Myopathien assoziiert, und eine fehlregulierte Expression wurde auch in tumorrelevanten Kontexten untersucht, in denen Proteostase und transkriptionelle Programme umgestaltet werden. Diese Eigenschaften machen TRIM32 zu einem hilfreichen Knotenpunkt, um ubiquitinabhängige Regulation, Zustandsübergänge von Muskelzellen und Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in Zellmodellen zu untersuchen.

TRIM32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM32-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRIM32 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM32-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM32-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRIM32-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM32-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRIM32-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRIM32-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM32-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.