transferrin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400871-ACT

Das menschliche TF-Gen kodiert Transferrin, ein sezerniertes Glykoprotein, das im Plasma dreiwertiges Eisen (Fe3+) bindet und es über transferrinrezeptorvermittelte Endozytose in Zellen einschleust; dadurch werden die mitochondriale Atmung, die DNA-Synthese und der Fortschritt des Zellzyklus unterstützt. Der transferrinabhängige Eisentransport ist in Programme der Eisenhomöostase eingebettet, die durch die posttranskriptionelle IRP/IRE-Regulation gesteuert werden, und steht über eisenkatalysierte Redoxchemie in Verbindung mit oxidativen Stressantworten. Eine dysregulierte Transferrinverfügbarkeit oder TF-Expression ist mit einer veränderten systemischen Eisenverteilung, inflammatorischer Signalgebung sowie Eisenüberladung oder funktionellem Eisenmangel assoziiert, was Hämatopoese und Gewebestoffwechsel beeinflusst. TF wird daher in zell- und molekularbiologischen Modellen breit untersucht, unter anderem im Kontext von Nährstoffsensorik, ferroptose-naher Anfälligkeit für lipidperoxidative Schäden und der Eisendynamik im Tumormikromilieu.

transferrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

transferrin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen transferrin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von transferrin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des transferrin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.