Topo IIα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400869-ACT

TOP2A kodiert die humane DNA-Topoisomerase IIα, ein ATP-abhängiges Enzym, das DNA-Superspiralisierung und DNA-Katenane durch die Erzeugung vorübergehender Doppelstrangbrüche auflöst und so eine zuverlässige Chromosomenkondensation und -segregation ermöglicht. Topo IIα ist ein zentraler Bestandteil von Stressantworten bei DNA-Replikation und Transkription und wird für die Entkettung (Decatenation) während der späten S-Phase sowie für den Übergang G2/M benötigt. Seine Aktivität ist eng mit der Zellzyklusregulation, der DNA-Schadenssignalgebung und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität verknüpft. Eine dysregulierte TOP2A-Expression ist häufig mit hochproliferativen Zuständen assoziiert und wird im Kontext chromosomaler Instabilität und krebsbezogener Biologie untersucht.

Topo IIα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOP2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Topo IIα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOP2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOP2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Topo IIα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOP2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Topo IIα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Topo IIα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOP2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.