Topo I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400965-ACT

Das humane Gen **TOP1** kodiert die DNA-Topoisomerase I (Topo I), ein nukleäres Enzym, das Torsionsspannungen abbaut, die während der DNA-Replikation und Transkription entstehen, indem es vorübergehende Einzelstrangbrüche erzeugt und die DNA anschließend wieder ligiert. Diese Aktivität unterstützt die Signalgebung der DNA-Schadensantwort, die Chromatindynamik und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und verknüpft die TOP1-Funktion mit Zellzyklusprogression und transkriptioneller Homöostase. Eine dysregulierte TOP1-Expression oder -Aktivität kann die Toleranz gegenüber Replikationsstress und die Genomintegrität verändern – Aspekte, die häufig in der Krebsbiologie und in Kontexten beeinträchtigter DNA-Reparatur untersucht werden. TOP1-abhängige Prozesse sind zudem relevant für Untersuchungen zur transkriptionsassoziierten genomischen Instabilität und zu zellulären Antworten auf Topoisomerase-Gifte.

Topo I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TOP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Topo I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TOP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TOP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Topo I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TOP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Topo I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Topo I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TOP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.