TLR8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401721-ACT

Humanes TLR8 (Toll-like-Rezeptor 8) ist ein endosomaler Mustererkennungsrezeptor, der uridinreiche einzelsträngige RNA aus Pathogenen und geschädigten Zellen erkennt und dadurch Signalwege der angeborenen Immunität initiiert. Nach Aktivierung rekrutiert TLR8 MyD88-abhängige Signalkaskaden, die NF-κB- und IRF-vermittelte Transkriptionsprogramme antreiben, die Expression entzündlicher Zytokine und Chemokine fördern und die Funktion antigenpräsentierender Zellen prägen. Die TLR8-Aktivität beeinflusst Antworten von Monozyten/Makrophagen und dendritischen Zellen und überschneidet sich mit Interferon- und Inflammasom-assoziierten Signalwegen, die die antimikrobielle Abwehr koordinieren. Eine fehlregulierte TLR8-Signalgebung wurde mit aberranten Entzündungszuständen und immunvermittelten Krankheitsmechanismen in Verbindung gebracht, wodurch TLR8 einen nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der Regulation der angeborenen Immunität und von Wirt–Erreger-Interaktionen darstellt.

TLR8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TLR8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TLR8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TLR8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TLR8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TLR8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TLR8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TLR8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TLR8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TLR8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.