Plasmide CRISPR d'Activation (h) Titin: sc-402827-ACT

Le gène humain **TTN** code la titine, une protéine sarcomérique géante qui s’étend du disque Z à la ligne M et agit comme échafaudage moléculaire et ressort afin de maintenir l’intégrité des myofibrilles, l’élasticité passive et la transmission de force dans le muscle strié. La titine coordonne l’assemblage du sarcomère via des interactions avec l’actine, la myosine et les complexes du disque Z/de la ligne M, et contribue à des processus de mécanosensation qui couplent l’étirement au remodelage de l’appareil contractile. L’activité de **TTN** s’intègre aux voies d’homéostasie structurelle musculaire, notamment l’organisation du cytosquelette, le contrôle qualité des protéines et la signalisation sensible au stress, qui façonnent la fonction des cardiomyocytes et des fibres musculaires squelettiques. La variation génétique et la dérégulation de **TTN** sont fortement associées à des phénotypes de maladies musculaires, ce qui en fait un locus central pour l’étude de la biologie du sarcomère et des relations génotype–fonction dans des modèles humains.

Titin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TTN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Titin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TTN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TTN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Titin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TTN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Titin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Titin dans les cellules tumorales présentant une expression de TTN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.