TIMP-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400685-ACT

Humanes **TIMP2** kodiert den Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen‑2 (TIMP‑2), einen sezernierten Regulator des Umsatzes der extrazellulären Matrix (EZM), der die Aktivität von Matrix‑Metalloproteinasen moduliert, einschließlich der Hemmung von MMP2, und so proteaseabhängige Umbauprozesse prägt. Durch das Austarieren metalloproteinasegetriebener Matrixdegradation und deren Inhibition beeinflusst TIMP‑2 Zellmigration, Adhäsion und Gewebearchitektur und ist damit mit Signalwegen verknüpft, die Invasion, Angiogenese und Wundheilung steuern. TIMP‑2 trägt zudem zur Kontrolle perizellulärer Proteolyse bei, unter anderem über Interaktionen mit membranassoziierten Faktoren wie MT1‑MMP, und beeinflusst dadurch Signale im Tumormikromilieu sowie fibrotisches Remodeling. Eine dysregulierte TIMP2‑Expression wurde mit veränderter EZM‑Dynamik in der Krebsbiologie, bei Entzündungszuständen und bei Bindegewebserkrankungen in Verbindung gebracht, was TIMP‑2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen matrixabhängiger Phänotypen macht.

TIMP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TIMP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIMP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TIMP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TIMP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIMP-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TIMP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIMP-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIMP-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TIMP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.