Thymidine Kinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402954-ACT

Das humane TK1 kodiert die Thymidinkinase 1, ein zytosolisches Enzym, das im Pyrimidin‑Salvage‑Pathway Thymidin zu Thymidinmonophosphat phosphoryliert und so ausgeglichene dTTP‑Pools unterstützt, die für DNA‑Replikation und ‑Reparatur erforderlich sind. Die TK1‑Expression ist eng an die S‑Phase und den Proliferationsstatus gekoppelt und ist in Programme der Zellzyklusregulation und des Nukleotidstoffwechsels integriert, die die Genomstabilität beeinflussen. Veränderte TK1‑Aktivität und ‑Expression wurden mit dysregulierter Proliferation und DNA‑Schadensantworten in der Krebsbiologie und anderen Kontexten in Verbindung gebracht, in denen Replikationsstress ausgeprägt ist. Als Ausleseparameter und Treiber der Nukleotidhomöostase wird TK1 häufig eingesetzt, um Replikationsdynamik, den Flux des Salvage‑Pathways und die zellzyklusabhängige metabolische Kontrolle zu untersuchen.

Thymidine Kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thymidine Kinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thymidine Kinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thymidine Kinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thymidine Kinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.