Thrombospondin 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405109-ACT

THBS3 kodiert Thrombospondin 3, ein sezerniertes Glykoprotein der extrazellulären Matrix, das Zell–Matrix-Interaktionen und die interzelluläre Signalübertragung in Bindegeweben moduliert. Mitglieder der Thrombospondin-Familie beeinflussen den Zusammenbau der Matrix, die Kollagenfibrillogenese und die Organisation von Proteoglykanen und prägen damit Programme der Adhäsion, Migration und Gewebeumgestaltung. Die Aktivität von THBS3 wird häufig im Zusammenhang mit der Homöostase der extrazellulären Matrix und mit Stressantworten untersucht, die die muskuloskelettale Entwicklung und die Knorpelbiologie beeinflussen. Fehlregulierte matricelluläre Signalgebung und eine veränderte ECM-Zusammensetzung sind wiederkehrende Merkmale degenerativer und fibrotischer Phänotypen, wodurch THBS3 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien matrixgetriebener Krankheitsprozesse darstellt.

Thrombospondin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen THBS3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Thrombospondin 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des THBS3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der THBS3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Thrombospondin 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native THBS3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Thrombospondin 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Thrombospondin 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem THBS3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.