Plásmido CRISPR de Activación (h) TFIIH p89: sc-401124-ACT

ERCC3 codifica la helicasa humana TFIIH p89 (XPB), un factor de desenrollamiento del ADN dependiente de ATP que es esencial tanto para el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa II como para la reparación por escisión de nucleótidos (NER). Dentro del complejo TFIIH, TFIIH p89 coordina la apertura del promotor durante la transcripción y participa en la verificación del daño y el desenrollamiento de la lesión durante la eliminación de aductos voluminosos del ADN, vinculando la regulación transcripcional con el mantenimiento del genoma. La alteración de los procesos de reparación mediados por ERCC3 y de los procesos acoplados a la transcripción se asocia con hipersensibilidad al estrés genotóxico y con trastornos sindrómicos que incluyen xeroderma pigmentoso y tricotiodeistrofia, lo que convierte a ERCC3 en un nodo clave en los estudios de las respuestas al daño del ADN y de la integridad de la transcripción.

TFIIH p89 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ERCC3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TFIIH p89 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ERCC3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ERCC3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TFIIH p89. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ERCC3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TFIIH p89 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TFIIH p89 en células tumorales con expresión de ERCC3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.