TEF-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402093-ACT

Humanes TEAD4 kodiert den Transkriptionsfaktor TEF-3, ein DNA-bindendes Protein der TEA-Domänenfamilie, das durch Interaktionen mit den Koaktivatoren YAP/TAZ als zentraler nukleärer Effektor des Hippo-Signalwegs fungiert. TEF-3 reguliert Genprogramme, die Zellproliferation, Überleben, epithelial-mesenchymale Transitionen und die Linienfestlegung während der Entwicklung steuern; nachgeschaltete Zielgene sind besonders in Signalwegen für Wachstum und zytoskelettales Remodelling angereichert. Eine Fehlregulation der TEAD4/TEF-3-abhängigen Transkriptionsaktivität wurde mit veränderter Gewebehomöostase und onkogenen Signalkontexten in Verbindung gebracht, in denen die Kontrolle durch den Hippo-Signalweg beeinträchtigt ist. Daher wird TEAD4 häufig als Knotenpunkt untersucht, der Mechanotransduktion und Zellschicksalsentscheidungen mit krankheitsrelevanten Transkriptionszuständen verknüpft.

TEF-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TEAD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TEF-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TEAD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TEAD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TEF-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TEAD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TEF-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TEF-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TEAD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.