Plásmido CRISPR de Activación (h) TDP1: sc-405057-ACT

La fosfodiesterasa tirosil-ADN 1 (TDP1) es una enzima de reparación del ADN que resuelve complejos covalentes topoisomerasa I–ADN detenidos mediante la hidrólisis de enlaces 3′-fosfotirosilo, restaurando extremos de ADN ligables durante la reparación de roturas de cadena sencilla. Esta actividad favorece la estabilidad del genoma durante la transcripción y el estrés replicativo, y se integra con vías coordinadas por PARP1, XRCC1 y la ligasa III del ADN para procesar intermediarios oxidativos y de ligación abortiva. La alteración de la función de TDP1 perturba la reparación de lesiones inducidas por topoisomerasa y se ha asociado con neurodegeneración y una mayor sensibilidad a agentes que dañan el ADN, lo que subraya su relevancia para estudios sobre el mantenimiento neuronal y las respuestas al estrés genotóxico. En investigaciones de biología del cáncer y biología cromosómica, TDP1 se examina con frecuencia por su papel en la tolerancia al daño del ADN, la integridad de la horquilla de replicación y la reparación de roturas de ADN asociadas a la transcripción.

TDP1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TDP1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TDP1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TDP1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TDP1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TDP1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TDP1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TDP1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TDP1 en células tumorales con expresión de TDP1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.