TCP-1 θ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404844-ACT

CCT8 codifica la subunità TCP-1 theta (CCTθ) dello chaperonina citosolica contenente TCP1 (TRiC/CCT), una macchina di ripiegamento dipendente dall’ATP essenziale per la proteostasi. TRiC supporta la biogenesi e la maturazione conformazionale di numerose proteine client, incluse componenti del citoscheletro come actina e tubulina, influenzando così l’organizzazione del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e il controllo qualità delle proteine in risposta allo stress. Attraverso il suo ruolo nel mantenere la capacità di ripiegamento, CCT8 è funzionalmente collegato a vie che regolano la stabilità del proteoma, l’integrità mitotica e le risposte cellulari allo stress proteotossico. Un’attività chaperoninica deregolata è stata associata a programmi di crescita e sopravvivenza alterati in oncologia e a processi di misfolding proteico rilevanti per fenotipi neurodegenerativi, rendendo CCT8 un nodo utile per studi meccanicistici della proteostasi.

TCP-1 θ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCT8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCP-1 θ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCT8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCT8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCP-1 θ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCT8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCP-1 θ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCP-1 θ nelle cellule tumorali con espressione di CCT8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.