Plasmide CRISPR d'Activation (h) TCP-1 θ: sc-404844-ACT

CCT8 code la sous-unité TCP-1 thêta (CCTθ) du complexe cytosolique de chaperonines contenant TCP1 (TRiC/CCT), une machine de repliement dépendante de l’ATP, essentielle au maintien de la protéostasie. TRiC soutient la biogenèse et la maturation conformationnelle d’un large éventail de protéines clientes, notamment des composants du cytosquelette tels que l’actine et la tubuline, influençant ainsi l’organisation du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire et le contrôle qualité des protéines en réponse au stress. Par son rôle dans le maintien de la capacité de repliement, CCT8 est fonctionnellement lié à des voies qui régissent la stabilité du protéome, l’intégrité mitotique et les réponses cellulaires au stress protéotoxique. Une activité de chaperonine dérégulée a été associée à des programmes de croissance et de survie altérés en biologie du cancer, ainsi qu’à des processus de mauvais repliement protéique pertinents pour des phénotypes neurodégénératifs, faisant de CCT8 un nœud utile pour des études mécanistiques de la protéostasie.

TCP-1 θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CCT8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TCP-1 θ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CCT8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CCT8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TCP-1 θ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CCT8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TCP-1 θ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TCP-1 θ dans les cellules tumorales présentant une expression de CCT8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.