TCP-1 η Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403833-ACT

CCT7 codifica la subunità TCP-1 η (CCTη) dello chaperonina citosolica contenente TCP-1, ovvero il complesso CCT/TRiC, una macchina di ripiegamento dipendente dall’ATP necessaria per la maturazione di proteine strutturalmente complesse come actina e tubulina. Sostenendo l’assemblaggio del citoscheletro, la proteostasi e il controllo qualità, CCT/TRiC influenza la progressione del ciclo cellulare, il traffico intracellulare e le risposte allo stress, inclusa l’interazione con le vie ubiquitina–proteasoma. Un’attività chaperoninica deregolata è stata associata a programmi alterati di omeostasi proteica osservati in contesti di malattie proliferative e neurodegenerative, rendendo CCT7 un nodo utile per studiare fenotipi dipendenti dal ripiegamento. Nelle cellule umane, la perturbazione dell’espressione di CCT7 può chiarire come la capacità chaperonica limiti la dinamica del citoscheletro e le reti di segnalazione che dipendono da proteine client correttamente ripiegate.

TCP-1 η Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCT7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCP-1 η Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCT7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCT7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCP-1 η. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCT7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCP-1 η nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCP-1 η nelle cellule tumorali con espressione di CCT7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.