TBC1D15 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426147-ACT

Tbc1d15 kodiert TBC1D15, ein Rab-GTPase-aktivierendes Protein, das den Membrantransport und die Dynamik von Organellen reguliert, mit ausgeprägten Funktionen im endosomalen Transport und in mitochondrienassoziierten Prozessen. Durch die Modulation Rab-abhängiger Vesikelbewegungen und der mitochondrialen Morphologie trägt TBC1D15 dazu bei, den zellulären Stoffwechsel, Stressantworten und den Abbau beschädigter Komponenten zu koordinieren. Fehlregulierter Transport und eine gestörte mitochondriale Homöostase sind wiederkehrende Merkmale bei Neurodegeneration, metabolischer Dysfunktion und in der Krebsbiologie, was das murine Tbc1d15 zu einem nützlichen Knotenpunkt für Studien auf Signalweg-Ebene macht. In murinen Systemen ermöglicht eine Veränderung der Tbc1d15-Expression mechanistische Untersuchungen der mitochondrialen Qualitätskontrolle, mit der Mitophagie verknüpfter Signalwege und intrazellulärer Transportphänotypen.

TBC1D15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tbc1d15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBC1D15 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tbc1d15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tbc1d15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBC1D15-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tbc1d15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBC1D15-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBC1D15-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tbc1d15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.