TASK-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403974-ACT

Das humane KCNK9-Gen kodiert TASK-3 (K2P9.1), einen Kaliumkanal der Zwei-Poren-Domäne, der zur basalen „Leak“-K+-Leitfähigkeit beiträgt und dabei hilft, das Ruhemembranpotenzial und die Membranexzitabilität festzulegen. TASK-3 ist gegenüber dem extrazellulären pH-Wert empfindlich und moduliert die Erregungseigenschaften in erregbaren Geweben, wodurch es die Ionenhomöostase mit zellulären Signalprogrammen wie calciumabhängigen Signalwegen und aktivitätsregulierter Transkription verknüpft. Über seinen Einfluss auf die Membranpolarisation wirkt TASK-3 auf Prozesse wie neuronale und endokrine Sekretion, Zellzyklusprogression sowie die Anpassung an metabolischen oder hypoxischen Stress. Eine veränderte Expression oder Funktion von KCNK9/TASK-3 wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und im Kontext der Krebsbiologie untersucht, wo kaliumkanalabhängige bioelektrische Signalgebung Proliferation und Überleben beeinflussen kann.

TASK-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNK9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TASK-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNK9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNK9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TASK-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNK9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TASK-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TASK-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNK9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.