SR-1D CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404213-ACT

HTR1D kodiert den humanen 5‑Hydroxytryptamin‑Rezeptor 1D (SR‑1D), einen Gi/o‑gekoppelten GPCR, der Serotonin bindet, um die Adenylylcyclase zu hemmen, die cAMP‑Signalübertragung zu reduzieren und die neuronale Erregbarkeit sowie die Neurotransmitterfreisetzung zu modulieren. SR‑1D ist an der serotonergen synaptischen Transmission und nachgeschalteten Signalwegen beteiligt, darunter cAMP/PKA, MAPK/ERK und die Regulation von Ionenkanälen; die funktionellen Effekte werden dabei durch Rezeptor‑Trafficking und Desensibilisierung mitbestimmt. Veränderungen von Expression und Signalgebung von HTR1D wurden in der neurovaskulären und neuropsychiatrischen Biologie untersucht, einschließlich Mechanismen, die für die Pathophysiologie von Kopfschmerzen und die Schmerzverarbeitung relevant sind. Als präsynaptischer Modulator stellt SR‑1D einen gut zugänglichen Angriffspunkt dar, um GPCR‑Signalbias, Neurotransmission auf Schaltkreisebene und ligandenabhängige Rezeptordynamik in humanen Zellmodellen zu analysieren.

SR-1D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HTR1D-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SR-1D Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HTR1D-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HTR1D-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SR-1D-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HTR1D-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SR-1D-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SR-1D-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HTR1D-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.