SPRED1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402981-ACT

SPRED1 (sprouty-related EVH1-Domäne enthaltendes Protein 1) ist ein negativer Regulator der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalübertragung, der die RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK-Kaskade abschwächt, indem er Neurofibromin (NF1) rekrutiert und die nachgeschaltete ERK-Aktivierung begrenzt. Durch diese hemmende Funktion trägt SPRED1 in mehreren Geweben zur Kontrolle von Zellproliferation, Differenzierung und der Reaktionsfähigkeit auf Wachstumsfaktoren bei. Genetische Störungen oder eine verringerte SPRED1-Aktivität stehen mit einer fehlregulierten MAPK-Signalgebung in Zusammenhang und werden mit neurokutanen Entwicklungsstörungen wie dem Legius-Syndrom in Verbindung gebracht; darüber hinaus ist SPRED1 auch in breiteren Kontexten relevant, in denen eine abnorme Ausgabe des RAS/MAPK-Signalwegs zelluläre Phänotypen verändert. SPRED1 ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um Feedbackkontrolle und Feinabstimmung von Signalwegen in der MAPK-abhängigen Biologie zu untersuchen.

SPRED1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPRED1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPRED1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPRED1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPRED1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPRED1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPRED1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPRED1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPRED1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPRED1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.