spectrin α I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403563-ACT

SPTA1 kodiert Spectrin αI, einen zentralen Bestandteil des Membranskeletts der Erythrozyten, der mit β-Spectrin Heterotetramere bildet und so ein flexibles Netzwerk erzeugt, das Form, Verformbarkeit und mechanische Stabilität roter Blutkörperchen unterstützt. Dieses Gerüst ist mit Aktin-haltigen Junction-Komplexen gekoppelt und über Adapter-Interaktionen an Membranproteine verankert, wodurch die zytoskelettale Organisation mit der Membranintegrität unter Scherstress verknüpft wird. Störungen der Spectrin-Assemblierung oder der Verbindung zwischen Membran und Skelett beeinträchtigen die Widerstandsfähigkeit von Erythrozyten und sind an erblichen hämolytischen Erkrankungen beteiligt, darunter die hereditäre Sphärozytose und die hereditäre Elliptozytose. Als struktureller Regulator wird SPTA1 zudem in Signalwegen untersucht, die die Zytoskelettdynamik, den Membrantransport und biomechanische Antworten steuern.

spectrin α I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPTA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

spectrin α I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPTA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPTA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen spectrin α I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPTA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von spectrin α I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des spectrin α I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPTA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.