SNARK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405079-ACT

Humanes NUAK2 kodiert SNARK (NUAK family SNF1-like kinase 2), eine AMPK-verwandte Serin/Threonin-Kinase, die den zellulären Energiestatus mit der Umgestaltung des Zytoskeletts, Zelladhäsion und stressadaptiver Signalgebung verknüpft. Die SNARK-Aktivität wird mit der Regulation von Zellmigration und -invasion, Programmen im Zusammenhang mit der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) sowie einer kontextabhängigen Kontrolle des Überlebens unter metabolischem Stress in Verbindung gebracht und überschneidet sich dabei mit Signalwegen downstream von LKB1 sowie mit Modulatoren der AKT/mTOR- und TGF-β-Signalgebung. Veränderte NUAK2/SNARK-Expression oder -Signalgebung wurde in mehreren Tumorkontexten sowie bei fibrotischen und entzündlichen Zuständen beschrieben, was mit Rollen in Gewebeumbau und Stressantworten vereinbar ist. Diese Eigenschaften machen NUAK2 zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung der kinasegetriebenen Regulation von Motilität, Stoffwechsel und transkriptioneller Anpassung in humanen Zellmodellen.

SNARK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NUAK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SNARK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NUAK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NUAK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SNARK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NUAK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SNARK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SNARK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NUAK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.