Plasmide CRISPR d'Activation (h) SETX: sc-402354-ACT

Le gène humain **SETX** code la sénataxine, une hélicase ADN/ARN de superfamille 1 qui résout les hybrides ARN:ADN (R-loops) et soutient la terminaison de la transcription, la résolution des conflits réplication–transcription et le maintien de la stabilité du génome. SETX participe à la réponse aux dommages de l’ADN, en couplant la maturation de l’ARN à la réparation des lésions associées à la transcription et en limitant les recombinaisons aberrantes au niveau de loci fortement transcrits. La perturbation de la fonction de SETX est associée à des phénotypes neurodégénératifs et neuromusculaires, notamment l’ataxie avec apraxie oculomotrice de type 2 et la sclérose latérale amyotrophique juvénile, ce qui souligne son importance dans le métabolisme de l’ARN et les voies de réponse au stress.

SETX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SETX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SETX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SETX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SETX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SETX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SETX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SETX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SETX dans les cellules tumorales présentant une expression de SETX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.