Plásmido CRISPR de Activación (h) Sec61α2: sc-402223-ACT

SEC61A2 codifica la subunidad humana Sec61α2, un componente central del translocón Sec61 que media la importación cotraduccional de polipéptidos nacientes al retículo endoplásmico y favorece la inserción de proteínas de membrana. Al acoplar el anclaje del ribosoma con la translocación al RE, Sec61α2 contribuye a la capacidad de la vía secretora, a la proteostasis del RE y a la coordinación con la degradación asociada al RE (ERAD) y con la señalización de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) durante el estrés proteotóxico. La alteración de la función del complejo Sec61 puede influir en la maduración de proteínas, el control de calidad y la adaptación celular al estrés, procesos que con frecuencia se implican en la biología de enfermedades proliferativas y metabólicas. Por lo tanto, SEC61A2 es relevante para estudiar la regulación de la capacidad de translocación al RE, la remodelación del secretoma y las vías de respuesta al estrés aguas abajo.

Sec61α2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SEC61A2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Sec61α2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SEC61A2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SEC61A2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Sec61α2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SEC61A2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Sec61α2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Sec61α2 en células tumorales con expresión de SEC61A2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.