SDHA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401689-ACT

SDHA kodiert die flavoproteinhaltige Untereinheit A des Succinatdehydrogenase-Komplexes, eine zentrale katalytische Komponente des mitochondrialen Komplexes II, die den Tricarbonsäurezyklus mit der Elektronentransportkette verbindet, indem sie Succinat zu Fumarat oxidiert und Elektronen auf Ubiquinon überträgt. Über seine Rolle in der oxidativen Phosphorylierung und der Redoxhomöostase beeinflusst SDHA die zelluläre ATP-Produktion, den mitochondrialen Stoffwechsel und das Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies. Eine veränderte SDHA-Funktion kann den bioenergetischen Fluss und die Metabolitensignalgebung stören, mit nachgelagerten Effekten auf die Hypoxieantwort und mitochondriale Stresssignalwege. Genetische und funktionelle Störungen von SDHA wurden mit Phänotypen mitochondrialer Erkrankungen und der Biologie SDH-defizienter Tumoren in Verbindung gebracht, was seine Eignung als Modellziel in der Stoffwechsel- und Krebsforschung unterstreicht.

SDHA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SDHA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SDHA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SDHA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SDHA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SDHA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SDHA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SDHA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SDHA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SDHA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.