SCOT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404705-ACT

Humanes OXCT1 kodiert die Succinyl-CoA:3-Oxoacid-CoA-Transferase (SCOT), ein mitochondriales Enzym, das den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Ketonkörperverwertung katalysiert, indem es Acetoacetat zu Acetoacetyl-CoA umsetzt, das anschließend in den Acetyl-CoA- und den Citratzyklus-(TCA-)Stoffwechsel eingespeist wird. Die SCOT-Aktivität verknüpft die Ketolyse mit der zellulären Bioenergetik, dem Redoxgleichgewicht und der metabolischen Flexibilität in Geweben, die unter Fastenbedingungen oder bei hohem Energiebedarf Ketonkörper oxidieren. Die OXCT1-Funktion ist mit der Fettsäureoxidation und dem mitochondrialen Acetyl-CoA-Fluss integriert und beeinflusst nachgeschaltete Prozesse wie die oxidative Phosphorylierung und anaplerotische Reaktionen. Genetische Veränderungen oder eine Fehlregulation des Ketonkörperstoffwechsels unter Beteiligung von OXCT1 wurden mit Phänotypen metabolischer Dysfunktion in Verbindung gebracht, was seinen Einsatz als Zielstruktur in Studien zur mitochondrialen Metabolik und Nährstoffsensorik unterstützt.

SCOT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OXCT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SCOT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OXCT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OXCT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SCOT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OXCT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SCOT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SCOT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OXCT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.