saposin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401394-ACT

PSAP kodiert Prosaposin, einen lysosomalen Vorläufer, der proteolytisch in die Saposine A–D verarbeitet wird, essenzielle Aktivatorproteine für Sphingolipid-Hydrolasen. Indem sie den Abbau von Glycosphingolipiden und Ceramiden fördern, unterstützen Saposine die Lysosomenfunktion, den Umsatz von Membranlipiden und die endolysosomale Homöostase und verknüpfen PSAP damit mit Autophagie‑Lysosomen‑Signalwegen und zellulären Stressantworten. Eine Störung der Prosaposin-Verarbeitung oder der Saposin-Aktivität beeinträchtigt den Sphingolipidstoffwechsel und führt zu Lipidspeicher-Phänotypen sowie zu zellulärer Pathologie, die mit Neurodegeneration assoziiert ist. Folglich wird PSAP in Modellen lysosomaler Speicherkrankheiten, der Myelin-Erhaltung und von Entzündungsprozessen, die durch veränderte Lipidsignalgebung getrieben sind, breit untersucht.

saposin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PSAP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

saposin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PSAP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PSAP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen saposin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PSAP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von saposin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des saposin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PSAP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.