SAC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404467-ACT

Das humane Gen **SACM1L** kodiert **SAC1**, eine mit dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat assoziierte Phosphoinositid-Phosphatase, die Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) hydrolysiert, um die Lipidzusammensetzung von Organellen aufrechtzuerhalten. Durch die Kontrolle der PI4P-Pools reguliert SAC1 den Membrantransport, die Integrität des Golgi-Apparats sowie den Lipidaustausch an ER–Golgi-Kontaktstellen und beeinflusst damit den Fluss durch den sekretorischen Weg und die zelluläre Homöostase. Die SAC1-abhängige Phosphoinositid-Signalgebung ist mit übergeordneten Signalwegen verknüpft, die Vesikelknospung, Cargosortierung und Stressanpassung im frühen sekretorischen Netzwerk steuern. Eine Fehlregulation der SACM1L-Aktivität und ein PI4P-Ungleichgewicht wurden mit veränderter Membrandynamik und Signalzuständen in Verbindung gebracht, die für die Biologie proliferativer und neuroentwicklungsbezogener Erkrankungen relevant sind.

SAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SACM1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SACM1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SACM1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SACM1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SACM1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.