SAC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404467-ACT

Il gene umano **SACM1L** codifica **SAC1**, una fosfatasi dei fosfoinositidi associata al reticolo endoplasmatico e all’apparato di Golgi che idrolizza il fosfatidilinositolo-4-fosfato (PI4P) per mantenere la composizione lipidica degli organelli. Controllando i pool di PI4P, SAC1 regola il traffico di membrana, l’integrità del Golgi e lo scambio di lipidi nei siti di contatto RE–Golgi, influenzando il flusso della via secretoria e l’omeostasi cellulare. La segnalazione dei fosfoinositidi dipendente da SAC1 si integra con vie più ampie che governano la gemmazione delle vescicole, lo smistamento del carico e l’adattamento allo stress nella rete secretoria precoce. Un’attività disfunzionale di SACM1L e uno squilibrio di PI4P sono stati collegati ad alterazioni della dinamica di membrana e degli stati di segnalazione rilevanti per la biologia di malattie proliferative e del neurosviluppo.

SAC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SACM1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SACM1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SACM1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SACM1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAC1 nelle cellule tumorali con espressione di SACM1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.