S3-12 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409516-ACT

Humanes **PLIN4** kodiert das lipidtröpfchenassoziierte Protein **S3-12**, ein Mitglied der Perilipin-Familie, das Organellen zur Speicherung neutraler Lipide strukturell organisiert und die Biogenese sowie den Umbau von Lipidtröpfchen koordiniert. S3-12 ist an der Adipozytendifferenzierung und am Lipidstoffwechsel beteiligt, indem es den Zugang von Lipasen und Transportfaktoren an der Tröpfchenoberfläche reguliert und dadurch den Fettsäurefluss, die zelluläre Energiebilanz und die metabolische Anpassung beeinflusst. Die PLIN4-Expression ist insbesondere in Fettgewebe- und Muskelkontexten angereichert und wird häufig in Signalwegen untersucht, die mit Insulinsensitivität, lipotoxischem Stress und entzündlicher Signalübertragung infolge veränderter Lipidspeicherung verknüpft sind. Eine Dysregulation der Perilipin-Dynamik, einschließlich Veränderungen der PLIN4/S3-12-Spiegel, wurde mit Phänotypen metabolischer Erkrankungen und gewebespezifischer Lipidakkumulation in Verbindung gebracht, was PLIN4 für mechanistische Studien zur adipositasassoziierten und kardiometabolischen Biologie relevant macht.

S3-12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PLIN4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

S3-12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PLIN4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PLIN4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen S3-12-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PLIN4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von S3-12-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des S3-12-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PLIN4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.