RPE65 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401489-ACT

RPE65 kodiert eine Retinoid-Isomerohydrolase, die für den visuellen Zyklus im retinalen Pigmentepithel essenziell ist, indem sie die Umwandlung von all-trans-Retinylestern zu 11-cis-Retinol katalysiert und so die Regeneration von Rhodopsin aufrechterhält. Diese Aktivität unterstützt die Phototransduktion, indem sie die Verfügbarkeit des Chromophors sicherstellt, und verknüpft den Retinoidstoffwechsel mit zellulären Prozessen wie Retinoltransport, Veresterung und oxidativen Stressantworten in der äußeren Netzhaut. Eine veränderte Expression oder Funktion von RPE65 ist mit einer beeinträchtigten Chromophor-Rezyklierung und einer Dysfunktion der Photorezeptoren assoziiert und macht RPE65 zu einem zentralen Knotenpunkt für die Untersuchung der retinalen Homöostase. In-vitro-Modelle, die auf einer Modulation von RPE65 basieren, werden eingesetzt, um die transkriptionelle Regulation des visuellen Zyklus sowie nachgeschaltete Signaländerungen zu analysieren, die für Phänotypen retinaler Degeneration relevant sind.

RPE65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPE65-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPE65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPE65-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPE65-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPE65-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPE65-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPE65-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPE65-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPE65-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.