RPE65 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401489-ACT

RPE65 codifica una isomerohidrolasi dei retinoidi essenziale per il ciclo visivo nell’epitelio pigmentato retinico, catalizzando la conversione degli esteri di retinile all-trans in 11-cis-retinolo per sostenere la rigenerazione della rodopsina. Questa attività supporta la fototrasduzione mantenendo la disponibilità del cromoforo e collega il metabolismo dei retinoidi a processi cellulari che includono il trasporto del retinolo, l’esterificazione e le risposte allo stress ossidativo nella retina esterna. Un’alterata espressione o funzione di RPE65 è associata a un riciclo del cromoforo compromesso e a disfunzione dei fotorecettori, rendendolo un nodo chiave per lo studio dell’omeostasi retinica. Modelli in vitro che sfruttano la modulazione di RPE65 vengono utilizzati per indagare la regolazione trascrizionale del ciclo visivo e le variazioni di segnalazione a valle rilevanti per fenotipi di degenerazione retinica.

RPE65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPE65 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RPE65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPE65 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPE65, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RPE65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPE65 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RPE65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RPE65 nelle cellule tumorali con espressione di RPE65 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.