Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPA 70 kDa subunit: sc-401454-ACT

RPA1 code la sous-unité de 70 kDa de la protéine A de réplication (RPA), un facteur de liaison à l’ADN simple brin à haute affinité qui stabilise l’ADN simple brin exposé (ssDNA) lors de la réplication, de la recombinaison et de multiples réactions de réparation de l’ADN. RPA1 coordonne le recrutement et l’activité d’enzymes clés de maintenance du génome, en soutenant des processus tels que la protection de la fourche de réplication, la réparation par excision de nucléotides et la recombinaison homologue, et elle s’interface avec la signalisation des dommages à l’ADN dépendante d’ATR en situation de stress réplicatif. En modulant l’activation des points de contrôle (checkpoints) et le choix des voies de réparation, RPA1 contribue à préserver l’intégrité génomique, et les altérations de sa fonction ou de son expression sont fréquemment étudiées dans le contexte des phénotypes d’instabilité génomique observés dans divers modèles de maladie.

RPA 70 kDa subunit Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RPA 70 kDa subunit Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RPA 70 kDa subunit. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RPA 70 kDa subunit au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RPA 70 kDa subunit dans les cellules tumorales présentant une expression de RPA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.