Rock-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400468-ACT

ROCK2 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2) kodiert Rock-2, eine Serin/Threonin-Kinase, die als zentraler Effektor von RhoA bei der Regulation der Aktin-Myosin-Kontraktilität fungiert. Rock-2 phosphoryliert Substrate wie die Myosin-Leichtkette und LIM-Kinasen, um die Bildung von Stressfasern, die Dynamik fokaler Adhäsionen, die Zellpolarität und die Zytokinese zu steuern und damit Zellmigration und Gewebearchitektur zu prägen. Über diese zytoskelettalen Effekte integriert ROCK2 Signale aus Signalwegen, die mit Mechanotransduktion, Umbau der extrazellulären Matrix sowie dem Tonus von Endothel- und glatter Muskulatur verknüpft sind. Eine Fehlregulation der ROCK2-Signalgebung wird mit verändertem invasivem Verhalten, vaskulärer Dysfunktion, Entzündungsreaktionen und fibroseassoziierten Prozessen in Verbindung gebracht, wodurch ROCK2 häufig als Ansatzpunkt genutzt wird, um zytoskelettgetriebene Krankheitsphänotypen zu untersuchen.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ROCK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ROCK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ROCK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rock-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ROCK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rock-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rock-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ROCK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.