RNF43 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403797-ACT

RNF43 kodiert eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die als negativer Regulator der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung wirkt, indem sie die Ubiquitinierung und den Abbau von Frizzled-Rezeptoren fördert und so die Menge an Wnt-Rezeptoren in der Plasmamembran begrenzt. Über diese Funktion trägt RNF43 zur Kontrolle der epithelialen Homöostase, der Stammzell-Signalgebung und von Proliferationsprogrammen bei, die empfindlich auf die Stärke des Wnt-Signalwegs reagieren. Veränderte RNF43-Aktivität wurde mit fehlregulierter Wnt-Signalgebung und genomischen Kontexten in Verbindung gebracht, die für die Tumorbiologie des Gastrointestinaltrakts und des Pankreas relevant sind, was RNF43 für Studien zur Signalwegabhängigkeit und zu Signal-Feedback-Mechanismen bedeutsam macht. RNF43 wird zudem als molekularer Ansatzpunkt genutzt, um die ubiquitinvermittelte Regulation des Rezeptor-Transports und das Cross-Talk zwischen Signalwegen zu untersuchen.

RNF43 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RNF43-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RNF43 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RNF43-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RNF43-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RNF43-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RNF43-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RNF43-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RNF43-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RNF43-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.