RGS9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404442-ACT

RGS9 kodiert den Regulator der G‑Protein‑Signalübertragung 9, ein GTPase‑aktivierendes Protein, das die Signalbeendigung nachgeschaltet von GPCRs beschleunigt, indem es die GTP‑Hydrolyse der Gα‑Untereinheit fördert. In neuronalen Geweben moduliert RGS9 dopaminerge und Opioidrezeptor‑Signalwege und trägt zur zeitlichen Steuerung der Second‑Messenger‑Signalübertragung bei, einschließlich cAMP‑abhängiger Prozesse und der Regulation von Ionenkanälen. In der Retina ist es ein zentraler Bestandteil der Erholung der Phototransduktion und prägt die Kinetik der visuellen Signalübertragung und Adaptation. Eine veränderte RGS9‑Expression oder ‑Funktion wurde mit Störungen der retinalen Signalübertragung sowie mit dysregulierten neuromodulatorischen Schaltkreisen in Verbindung gebracht, die für bewegungs- und belohnungsbezogene Phänotypen relevant sind.

RGS9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RGS9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RGS9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RGS9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RGS9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RGS9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RGS9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RGS9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RGS9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RGS9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.