RGS9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404442-ACT

RGS9 codifica il regolatore della segnalazione delle proteine G 9, una proteina ad attività GTPasica (GTPase-activating protein, GAP) che accelera la terminazione del segnale a valle dei recettori accoppiati a proteina G (GPCR) promuovendo l’idrolisi del GTP della subunità Gα. Nei tessuti neuronali, RGS9 modula le vie dei recettori dopaminergici e oppioidi e contribuisce al controllo temporale della segnalazione dei secondi messaggeri, inclusi i processi dipendenti da cAMP e la regolazione dei canali ionici. È un componente chiave del recupero della fototrasduzione nella retina, determinando la cinetica della segnalazione visiva e dell’adattamento. Alterazioni dell’espressione o della funzione di RGS9 sono state associate a difetti della segnalazione retinica e a circuiti neuromodulatori deregolati, rilevanti per fenotipi legati al movimento e alla ricompensa.

RGS9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RGS9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RGS9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RGS9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RGS9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RGS9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RGS9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RGS9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RGS9 nelle cellule tumorali con espressione di RGS9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.