RFX6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408496-ACT

RFX6 (regulatory factor X6) ist ein Winged-Helix-Transkriptionsfaktor, der genregulatorische Programme koordiniert, die für die Entwicklung des endokrinen Pankreas und die Aufrechterhaltung der Identität der Pankreasinseln erforderlich sind. In menschlichen Zellen trägt RFX6 zu Transkriptionsnetzwerken bei, die die Differenzierung von Beta-Zellen, die Insulinsekretionsfunktion und die übergeordnete Glukosehomöostase steuern, indem es linienspezifische Promotoren und Enhancer reguliert. Eine veränderte RFX6-Aktivität wurde mit angeborenen endokrinen Erkrankungen des Pankreas und des Darms sowie mit diabetesassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was RFX6 zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung des endokrinen Zellschicksals, von Stressantworten und metabolischer Signalwege macht. Als nuklearer Regulator wird RFX6 häufig mittels Expressionsprofilierung und chromatinbasierter Assays untersucht, um nachgeschaltete Zielgene und interagierende transkriptionelle Schaltkreise zu definieren.

RFX6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RFX6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RFX6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RFX6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RFX6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RFX6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RFX6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RFX6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RFX6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RFX6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.