Plásmido CRISPR de Activación (h) Rent1: sc-402462-ACT

La UPF1 (Rent1) humana es una helicasa de ARN dependiente de ATP y un efector central de la degradación de ARNm mediada por codones sin sentido (NMD), una vía conservada que detecta y degrada transcritos que contienen codones de terminación prematuros. Mediante interacciones con proteínas SMG y el complejo de unión a exones, UPF1 acopla la vigilancia de la terminación de la traducción a la remodelación de los mRNP, el control de calidad del ARN y la regulación de isoformas normales de transcritos. Más allá de la NMD, UPF1 contribuye al mantenimiento de los telómeros, la estabilidad del genoma y el metabolismo del ARN en respuesta al estrés, conectando la vigilancia del ARN con una homeostasis celular más amplia. La actividad desregulada de UPF1 se ha asociado con alteraciones en la integridad del transcriptoma y una producción anómala del proteoma en contextos que incluyen la tumorogénesis y fenotipos del neurodesarrollo, lo que respalda su utilidad para estudios mecanísticos de la regulación del ARN.

Rent1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UPF1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rent1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UPF1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UPF1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rent1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UPF1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rent1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rent1 en células tumorales con expresión de UPF1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.