Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rent1: sc-402462-ACT

UPF1 (Rent1) humain est une hélicase ARN dépendante de l’ATP et l’effecteur central de la dégradation des ARNm médiée par les codons non-sens (NMD), une voie conservée qui détecte et dégrade les transcrits contenant des codons stop prématurés. Par ses interactions avec les protéines SMG et le complexe de jonction des exons, UPF1 couple la surveillance de la terminaison de la traduction au remodelage des mRNP, au contrôle qualité des ARN et à la régulation d’isoformes normales de transcrits. Au-delà de la NMD, UPF1 contribue au maintien des télomères, à la stabilité du génome et au métabolisme des ARN en réponse au stress, reliant la surveillance des ARN à l’homéostasie cellulaire au sens large. Une activité d’UPF1 dérégulée a été associée à une altération de l’intégrité du transcriptome et à une production protéomique aberrante dans des contextes incluant la tumorigenèse et des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui étaye son intérêt pour des études mécanistiques de la régulation des ARN.

Rent1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UPF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rent1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UPF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UPF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rent1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UPF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rent1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rent1 dans les cellules tumorales présentant une expression de UPF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.