Plasmide CRISPR d'Activation (h) Raptor: sc-400960-ACT

Le gène humain RPTOR code Raptor, un composant d’échafaudage essentiel du complexe mTOR 1 (mTORC1) qui recrute des substrats tels que S6K et 4E‑BP1 afin de coordonner les signaux liés aux nutriments, à l’énergie et aux facteurs de croissance avec la synthèse protéique, la suppression de l’autophagie et la reprogrammation métabolique. En régulant la spécificité des substrats de mTORC1 ainsi que sa localisation, Raptor influence la croissance cellulaire, la progression du cycle cellulaire, la biogenèse des ribosomes et la signalisation associée aux lysosomes. Une activité dérégulée de RPTOR/mTORC1 a été associée à une altération de la signalisation anabolique observée en biologie des cancers, dans les maladies métaboliques, ainsi que dans des contextes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs, ce qui en fait un nœud couramment utilisé pour l’étude des voies de signalisation. La modulation de l’expression de RPTOR constitue une approche directe pour étudier les rétroactions entre la signalisation PI3K–AKT, l’AMPK et les voies de détection des nutriments qui façonnent l’homéostasie cellulaire.

Raptor Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPTOR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Raptor Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPTOR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPTOR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Raptor. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPTOR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Raptor au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Raptor dans les cellules tumorales présentant une expression de RPTOR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.