Plasmide CRISPR d'Activation (h) RAPGEF6: sc-403816-ACT

RAPGEF6 (également connu sous le nom de PDZ-GEF2) code un facteur d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) spécifique de Rap, qui active les GTPases RAP1 et RAP2 afin de coordonner la signalisation « inside-out » des intégrines, le remodelage du cytosquelette et la dynamique des jonctions cellule–cellule. En régulant des voies dépendantes de Rap, RAPGEF6 contribue au contrôle de l’adhérence, de la migration et de la polarité cellulaires dans de nombreux contextes tissulaires. Son activité s’insère dans des réseaux de signalisation en aval de récepteurs qui influencent les circuits MAPK et ceux des petites GTPases, modulant le trafic intracellulaire et la signalisation à proximité de la membrane. La dérégulation de la signalisation Rap et des programmes d’adhérence associés à RAPGEF6 est pertinente pour l’étude des comportements cellulaires invasifs, du trafic des cellules immunitaires et d’autres altérations de l’organisation tissulaire liées à des maladies.

RAPGEF6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAPGEF6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAPGEF6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAPGEF6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAPGEF6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAPGEF6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAPGEF6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAPGEF6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAPGEF6 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAPGEF6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.