RAMP3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402235-ACT

La proteina 3 modulatrice dell’attività del recettore (RAMP3) è una proteina accessoria di membrana a passaggio singolo che forma eterodimeri con specifici GPCR di classe B, inclusi il recettore simile a quello della calcitonina e il recettore della calcitonina, determinando la specificità di legame del ligando, il traffico recettoriale e il bias della segnalazione a valle. Modellando i complessi recettoriali della famiglia adrenomedullina/CGRP, RAMP3 influenza le vie dipendenti da cAMP e processi più ampi come la segnalazione endoteliale, la funzione di barriera e l’omeostasi cellulare, attraverso la modulazione dell’internalizzazione e del riciclo del recettore. Alterazioni nell’espressione di RAMP3 sono state associate a programmi di segnalazione GPCR deregolati, rilevanti per la fisiologia cardiovascolare e per reti di segnalazione associate ai tumori, a sostegno del suo utilizzo come nodo per studi meccanicistici della farmacologia recettoriale e della regolazione dello stato cellulare. Queste proprietà rendono RAMP3 umano un bersaglio utile per analizzare l’assemblaggio dei complessi recettoriali e le dinamiche di trasduzione del segnale in modelli cellulari fisiologicamente pertinenti.

RAMP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAMP3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RAMP3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAMP3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAMP3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RAMP3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAMP3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RAMP3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RAMP3 nelle cellule tumorali con espressione di RAMP3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.