Plásmido CRISPR de Activación (h) RAMP3: sc-402235-ACT

La proteína modificadora de la actividad del receptor 3 (RAMP3) es una proteína accesoria de membrana de paso único que forma heterodímeros con determinados GPCR de clase B, incluidos el receptor similar al receptor de calcitonina y el receptor de calcitonina, para determinar la especificidad del ligando, el tráfico del receptor y el sesgo de la señalización aguas abajo. Al configurar los complejos receptores de la familia adrenomedulina/CGRP, RAMP3 influye en vías dependientes de AMPc y en procesos más amplios como la señalización endotelial, la función de barrera y la homeostasis celular mediante la modulación de la internalización y el reciclaje del receptor. La alteración de la expresión de RAMP3 se ha asociado con programas de señalización de GPCR desregulados relevantes para la fisiología cardiovascular y redes de señalización asociadas a tumores, lo que respalda su uso como un nodo para estudios mecanísticos de la farmacología del receptor y la regulación del estado celular. Estas propiedades hacen que el RAMP3 humano sea un objetivo útil para desentrañar el ensamblaje de complejos receptores y la dinámica de transducción de señales en modelos celulares fisiológicamente relevantes.

RAMP3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAMP3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RAMP3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAMP3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAMP3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RAMP3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAMP3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RAMP3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RAMP3 en células tumorales con expresión de RAMP3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.