Plasmide CRISPR d'Activation (m2) RAGE: sc-419040-ACT-2

Chez la souris, Ager code le récepteur des produits de glycation avancée (RAGE), un récepteur de reconnaissance de motifs multiligand appartenant à la superfamille des immunoglobulines, qui se lie aux AGEs, aux protéines S100, à HMGB1 et à des ligands associés à l’amyloïde afin d’amplifier les voies de signalisation du stress cellulaire. L’activation de RAGE favorise une transcription dépendante de NF-κB, l’engagement des voies MAPK et JAK/STAT, la production d’espèces réactives de l’oxygène et une expression prolongée de gènes inflammatoires, susceptibles d’influencer l’activation endothéliale, le recrutement des leucocytes et le remodelage tissulaire. Dans les systèmes murins, la biologie d’Ager/RAGE est souvent étudiée dans des contextes d’inflammation métabolique, de dysfonction vasculaire, de neuroinflammation et de processus liés à la fibrose, où s’entrecroisent l’accumulation de ligands et la signalisation innée chronique. L’édition génétique d’Ager dans des cellules ou des modèles murins permet une analyse mécanistique de la signalisation spécifique de chaque ligand, du dialogue du récepteur avec les récepteurs de type Toll et des programmes transcriptionnels en aval pertinents pour les tissus immunitaires et barrières.

RAGE Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ager sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAGE Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ager dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ager, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAGE. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ager natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAGE au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAGE dans les cellules tumorales présentant une expression de Ager silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.