Rad54B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403794-ACT

RAD54B kodiert eine menschliche, DNA-abhängige ATPase aus der SWI2/SNF2-Familie, die an der homologen Rekombination und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt ist. Rad54B wirkt an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen mit, indem es die RAD51-vermittelte Stranginvasion erleichtert, das Chromatin remodeliert und Rekombinationsintermediate unter Replikationsstress weiterverarbeitet. Über seine Funktion in der DNA-Schadensantwort unterstützt RAD54B eine fehlerfreie Chromosomensegregation und trägt dazu bei, die Mutationslast zu begrenzen. Eine Dysregulation oder veränderte Aktivität von RAD54B wurde in experimentellen Systemen mit Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie relevant sind, sowie mit einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Substanzen.

Rad54B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAD54B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rad54B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAD54B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAD54B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rad54B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAD54B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rad54B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rad54B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAD54B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.