Rad50 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401617-ACT

Das humane RAD50-Gen kodiert Rad50, eine Kernkomponente des MRN-(MRE11-RAD50-NBN)-Komplexes, der DNA-Doppelstrangbrüche erkennt und die Signalweiterleitung der DNA-Schadensantwort koordiniert. Die ATPase- und Tethering-Aktivitäten von Rad50 helfen dabei, gebrochene DNA-Enden zu überbrücken, und unterstützen homologe Rekombination, nicht-homologes End-Joining, die Stabilität von Replikationsgabeln sowie die Telomererhaltung. Durch die funktionelle Kopplung an die ATM-abhängige Checkpoint-Aktivierung und die Kontrolle der Endresektion beeinflusst RAD50 den Zellzyklusarrest und Programme der Genomüberwachung. Eine Fehlregulation der MRN-Komplexaktivität und RAD50-assoziierte Defekte der DNA-Reparatur werden mit Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die häufig in der Krebsbiologie und bei erblichen DNA-Reparaturerkrankungen untersucht werden.

Rad50 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAD50-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rad50 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAD50-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAD50-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rad50-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAD50-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rad50-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rad50-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAD50-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.