Plásmido CRISPR de Activación (h) Rad50: sc-401617-ACT

El RAD50 humano codifica Rad50, un componente central del complejo MRN (MRE11-RAD50-NBN) que detecta roturas de doble cadena del ADN y coordina la señalización de la respuesta al daño del ADN. Las actividades ATPasa y de “tethering” (anclaje/puenteo) de Rad50 ayudan a unir los extremos de ADN rotos y respaldan la recombinación homóloga, la unión de extremos no homóloga, la estabilidad de las horquillas de replicación y el mantenimiento de los telómeros. Mediante su acoplamiento funcional a la activación del punto de control dependiente de ATM y al control de la resección de extremos, RAD50 influye en la detención del ciclo celular y en los programas de vigilancia del genoma. La desregulación de la actividad del complejo MRN y los defectos de reparación del ADN asociados a RAD50 se relacionan con fenotipos de inestabilidad genómica que se estudian con frecuencia en biología del cáncer y en trastornos hereditarios de reparación del ADN.

Rad50 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAD50 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rad50 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAD50 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAD50, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rad50. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAD50 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rad50 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rad50 en células tumorales con expresión de RAD50 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.